《刺客信条2》背景设定在文艺复兴时期的意大利，距离第一代有三百多年。在调酒师Desmond Miles的DNA里，Abstergo公司发现了他另一位祖先的记忆，生活在十五世纪末的贵族Ezio Auditore Di Firenze。这个年轻人遭到家族背叛，被迫踏上踏上复仇之路，最终Ezio和Desmond将发现一个埋藏已久的惊天阴谋，它将对今天的世界产生巨大影响。